绝经后骨质疏松症 (Postmenopausal osteoporosis, PMOP) 是一种全身性骨病，其特征是骨量低和微结构损伤。随着病情的发展，包括背痛、骨质疏松性骨折、脊柱畸形、多器官功能障碍等多种症状逐渐显现，给绝经后妇女带来巨大的身体、心理、经济负担。目前临床上使用的抗骨质疏松药物大多存在疗程长、全身副作用大、患者依从性低等问题。因此，PMOP的治疗需要开发高效且安全的药物。近年来，随着中药治疗骨质疏松症临床研究的不断深入，天然生物活性物质的研究日益受到重视。巴戟天（Morinda Officinalis, MO) 在中国用于治疗骨折和关节疾病的历史悠久，含有多种具有抗 PMOP 活性的成分，包括多糖、低聚糖、蒽醌类等。以往的研究主要集中在 MO 多糖上，这些多糖具有缓解骨质疏松症、抑制破骨细胞分化和促进成骨细胞分化的作用。巴戟天源性细胞外囊泡样颗粒（Morinda Officinalis-derived extracellular vesicle-like particles, MOEVLPs）是从 MO 中分离出来的新活性成分，富含核酸、蛋白质和脂质等生物大分子，同时保持着高纯度的特点。目前尚无相关研究探讨其抗骨质疏松作用和机制。

　　有效分离：通过差速离心+超速离心法获得高纯度MOEVLPs（纯度60.3%），平均粒径61.24±12.74 nm

　　骨靶向性：体内分布实验显示MOEVLPs在给药24小时后主要富集于骨组织（荧光信号强度↑3.8倍）

　　双重安全性：H&E染色证实对心、肝、脾、肺、肾无开云智能科技中国股份有限公司毒性，且不引起子宫萎缩（子宫指数↑42%）

　　通过差速离心、超速离心和过滤步骤从 MO 果汁中分离 MOEVLP。TEM 分析显示 MOEVLP 表现出圆形或杯形形态（图1A）。MOEVLPs 的平均直径为 61.24 ± 12.74 nm，MOEVLPs 的浓度为 2.25 × 1012颗粒/ml（图1B）。Triton X-100 膜破裂试验表明，分离的 MOEVLP 的纯度达到近 60.3%（图1C）。此外，MOEVLP 还含有丰富的生物大分子，如核酸、蛋白质和脂质（图1D-F）。这些结果共同证实了我们分离高纯度和高质量细胞外囊泡样纳米颗粒的能力，为后续研究 MOEVLPs 的生物学功能和机制奠定了基础。

　　基于 MO 的抗骨质疏松特性，我们进行了体内研究以评估 MOEVLP 的分布和抗 PMOP 效果。动物实时成像系统揭示了 MOEVLP 具有明确的骨骼靶向能力（图2A）。骨荧光信号在 DiR-MOEVLPs 给药后 24 小时最为明显，48 h 时骨骼中仍存在大量 DiR-MOEVLPs（图2 B和C）。MOEVLP 的骨骼靶向是我们后续研究的基础。

　　建立 PMOP 小鼠模型，并以阿仑膦酸盐作为阳性对照药物进行 MOEVLPs 治疗 21天（图2D）。在正式实验前，用少量 PMOP 模型 （3 只小鼠/组） 进行了初步测试，并使用子宫指数评价药物剂量和模型质量。低 MOEVLPs 组采用骨靶向实验的药物剂量，High-MOEVLPs 组的药物剂量为3 × 1011颗粒/ml。MOEVLPs治疗21d后，OVX组小鼠子宫指数显著高于Sham组小鼠，表明PMOP模型构建成功。此外，High-MOEVLPs组和Low-MOEVLPs组小鼠的子宫指数介于OVX组和Sham组之间，高浓度组小鼠的子宫指数远高于ALN组，说明设定的MOEVLPs浓度合理，具有良好的抗PMOP效果（图2在下面的正式实验中，使用 Micro-CT 验证 MOEVLPs 的抗 PMOP 效果。骨微结构的 2D 标测（冠状视图）和 3D 重建表明，通过灌胃施用 MOEVLP 可有效减少骨质流失并缓解 PMOP （图2E）。MOEVLPs 处理 21 天后，BV、BV/TV、BS、BS/TV 和 TMC 等参数显示显着增加，而 Tb.Sp 显着降低（图2G-K）。这些发现共同表明 MOEVLP 具有抗 PMOP 活性，管饲法给药是递送 MOEVLP 的有效方法。

　　为了进一步探讨 MOEVLPs 治疗的安全性，对不同组小鼠用 MOEVLPs 处理 21 天后的心、肝、脾、肺、肾组织切片进行 H&E 染色。H&E 染色结果证明 MOEVLPs 对这些器官没有造成任何损害。同时，股骨组织的 H&E 染色证明了 PMOP 小鼠模型的成功建立和 MOEVLP 在缓解 PMOP 方面的有效性（图3A）。

　　流式细胞术结果显示，含有荧光信号的 MC3T3-E1 细胞百分比随着孵育时间的延长和 MOEVLPs 浓度的增加而增加。当 MOEVLP 浓度达到 1 × 109 颗粒/ml，孵育时间为 8 h，含有 MOEVLPs 的细胞比例达到 98.84 %。共聚焦图像显示 MOEVLP 被 MC3T3-E1 有效吸收并定位于细胞的细胞质中。荧光强度随着共孵育时间的延长和 MOEVLPs 浓度的增加而增加 （图4D）。

　　选择了两种浓度，5 × 108颗粒数/ml 和 1 × 109对 MC3T3-E1 表现出最佳内化效果的 MOEVLP 的颗粒/ml，以进行 BMSC 的内化吸收实验（图 5A）。流式细胞术结果显示，在孵育时间为 8 小时且 MOEVLPs 浓度为 1 × 109颗粒/ml，BMSCs 的内化吸收率仅为 67.2 %，显著低于 MC3T3-E1 对 MOEVLPs 的内化吸收作用（图5B）。同样，共聚焦图像的结果也支持这一结论（图5C）。细胞完全内化和吸收 MOEVLP 的能力是决定 MOEVLP 对细胞影响的关键因素。因此，基于上述发现，我们选择了 MC3T3-E1 细胞用于后续研究 MOEVLPs 缓解 PMOP 的机制。

　　为了阐明 MOEVLP 促进 MC3T3-E1 细胞增殖的机制，用 MOEVLP 处理 MC3T3-E1 （1 × 109颗粒 /ml）。在 24、48 和 72 小时，收集了 10 个7用于蛋白质组学分析的细胞。同时，收集了 107 以无任何处理因子的 开云智能科技中国股份有限公司MC3T3-E1 细胞为对照组。基因本体论 （GO） 和京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 通路分析显示，MC3T3-E1 细胞的丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信号通路在 MOEVLPs 处理后被显著激活（图6A）。MAPK 通路相关蛋白表达水平 （CREB、RSK1） 显著升高（图 6B 和 C）。丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 通路是控制基本细胞过程（包括增殖、分化和凋亡）的最明确的细胞信号通路之一。为了进一步证实 MAPK 信号通路在 MOEVLPs 促进 MC3T3-E1 细胞增殖中的作用，在 MOEVLPs 处理的 MC3T3-E1 细胞上采用了信号 MAPK 通路抑制剂PD98059。研究结果表明，PD98059 有效抑制了 MOEVLPs 的增殖作用 （图6D）。Western blot 结果还表明，MOEVLPs 处理后 MC3T3-E1 细胞中的 CREB 和 RSK1 表达显著增加，PD98059可以逆转这一表达趋势（图6E-H）。这些结果证实了 MAPK 信号通路及其相关蛋白在促进 MC3T3-E1 细胞增殖的 MOEVLPs 中的作用和意义。

　　HPLC指纹图谱建立MOEVLPs质量控制标准（特征峰匹配度95%）

　　这项研究将传统中药理论与现代纳米医学完美结合，为骨质疏松治疗开辟了新赛道。

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